加強型RIPA裂解液實驗技巧

描述： 加強型RIPA裂解液加強型對動物細(xì)胞胞膜、胞漿、胞核成分有較強裂解作用，是常用的細(xì)胞組織快速裂解液。使用加強型RIPA 裂解液特別適于提取膜蛋白以及western blot和大多數(shù)蛋白-蛋白相互作用的實驗等。

儲存：
4 ℃保存 12個月有效

規(guī)格：
100ml  500ml

制備細(xì)胞裂解產(chǎn)物
1. 800g4℃離心5分鐘收集培養(yǎng)細(xì)胞，估計細(xì)胞離心后的體積（PCV,106cells=~20ul,107cells =~100ulPCV）；
2. 每50-100ulPCV加入5倍體積RIPA裂解緩沖液（250-500ul）,冰浴中放置10分鐘，并每隔5分鐘在漩渦混合儀上振蕩30秒；
3. 12000g4℃離心10分鐘,將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，即得細(xì)胞總蛋白產(chǎn)物；
4. 假如所得蛋白產(chǎn)物較為粘稠，95℃加熱5分鐘，然后迅速冰浴5分鐘，12000g4℃離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，即得細(xì)胞總蛋白產(chǎn)物。

制備組織裂解產(chǎn)物
1. 取50-100mg組織在冰上剪成碎片，用預(yù)冷的PBS洗滌2次離心棄去PBS；
2. 加入0.5-1ml預(yù)冷RIPA裂解緩沖液；
3. 4℃用玻璃勻漿器勻漿20-40次，直到95％的細(xì)胞被破碎，然后在冰浴中放置10分鐘，并每隔5分鐘在漩渦混合儀上振蕩30秒；
4. 12000g4℃離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，即得組織總蛋白產(chǎn)物；
5. 假如所得蛋白產(chǎn)物較為粘稠，95℃加熱5分鐘，然后迅速冰浴5分鐘，12000g4℃離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，即得組織總蛋白產(chǎn)物；
6. 20％的甘油保存于-70oC或-20oC。

注意：
1. 在轉(zhuǎn)移上清液時不要吸入底部的沉淀物；
2. 在做免疫沉淀或免疫共沉淀時最好在實驗前進行蛋白的提取，以避免某些不穩(wěn)定蛋白的降解；
3. 在該RIPA裂解緩沖液中未加入蛋白酶抑制劑。